| 滨海耐盐植物田菁共生根瘤菌的宿主特异性分析及趋化功能研究 |
| 党消消
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| 学位类型 | 博士
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| 导师 | 解志红
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| 2020-05
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| 学位授予单位 | 中国科学院大学
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| 学位授予地点 | 烟台海岸带研究所
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| 学位名称 | 博士学位
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| 关键词 | 碱土剑菌YIC4027，全基因组，宿主特异性，趋化，共生
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| 摘要 | 黄河三角洲地区自然资源丰富，地域辽阔，是一块有待开发的重要耕地资源。该地区具有典型的海岸带环境特征，在由沿海到陆地的原生演替过程中，形成了不同的盐度梯度。耐盐植物及其根际微生物群落共同影响土壤的理化性质，对于盐碱地土壤修复、土壤元素循环及维持湿地生态系统稳定等方面起着重要的作用。然而，盐生植物与土壤因素对根际微生物的影响还很不清楚。本论文首先采用了宏基因组测序技术对海陆演替过程中一些盐生植被根系土壤的微生物菌群和功能基因进行了初步分析，鉴定出剑菌属（Ensifer）是野大豆根际的优势物种。为耐盐植物-根瘤菌共生固氮体系应用于滨海盐碱地的改良提供了理论依据。
田菁（Sesbania cannabina）是改良滨海盐碱地的一种典型的先锋豆科植物，能与剑菌属（Ensifer）、根瘤菌属（Rhizobium）、异根瘤菌属（Allorhizobium）和新根瘤菌属（Neorhizobium）的多种根瘤菌共生互作形成根瘤。田菁-根瘤菌共生固氮体系在滨海盐碱地修复中具有良好的应用效果。然而，不同根瘤菌与田菁共生能力存在着很大差异。Ensifer alkalisoli YIC4027是本实验室从田菁根际筛选到的一株具有促生、固氮结瘤、促进植物耐盐碱功能的根瘤菌，在根瘤菌菌群中占有主导地位，且具有严格的宿主特异性。然而这种特异且高效的共生机制还不清楚。
为阐明田菁与根瘤菌的互作机制，本论文采用全基因组测序技术和比较基因组学方法研究了E. alkalisoli YIC4027基因组的基本特征、分析了E. alkalisoli YIC4027的系统发育地位及宿主特异性。此外，对YIC4027的趋化系统、核心趋化蛋白以及未知功能的趋化蛋白进行了研究，为YIC4027在共生过程中具备的高效竞争性提供了一定的理论依据。本论文揭示了根瘤菌与田菁特异性和高效性共生的遗传机制，主要研究结果如下：
1. 宏基因组测序分析结果表明，碱蓬（SS）、野大豆-芦苇（GP）根际和光滩（BW）土壤中含有较高的细菌丰度（90%-93%），较少的真菌（1.9%-2.88%）和古菌（0.43%-3.56%）。三个样点中变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和绿湾菌门占主要地位，其中，变形菌门是最主要的门，在碱蓬根际中占71.5%，在野大豆-芦苇根际中占61.4%，在光滩土壤中占55.5%。不同植被和土壤类型对微生物菌群有着显著的影响。野大豆-芦苇根际剑菌属的含量最多，可能与生物固氮有关。碱蓬根际海杆菌属含量最多，而光滩土壤中芽单胞菌属的含量最多。对三个样点的功能基因分析表明，参与氨基酸转运和代谢，碳水化合物转运和代谢以及能量代谢的基因最多。与其他两个位点相比，野大豆-芦苇根际中含有较多的群体感应基因和ABC转运体基因。碱蓬根际中含有较多的氮还原基因。
2. E. alkalisoli YIC4027基因组由1条染色体和2个质粒组成，基因组大小为6,128,433 bp。其中，染色体大小为3,690,234 bp，共生质粒pYIC4027a为456,424 bp，质粒pYIC4027b为1,981,775 bp。GenBank序列号为CP034909-CP034911。YIC4027与E. fredii有很多的直系同源基因，二者之间的染色体有保守的共线性关系。利用核心基因对YIC4027进行了系统发育地位分析，发现E. alkalisoli的近缘菌株为E. fredii。鉴定出YIC4027与E. fredii宿主范围差异的潜在因素，主要为结瘤因子基因及蛋白分泌系统基因之间存在差别。
3. E. alkalisoli YIC4027含有两个趋化基因簇che1和che2，且两个簇上分别含有一个趋化核心组氨酸激酶基因cheA。分别对其进行了基因敲除，结果表明敲除che1基因簇或者cheA1导致趋化功能完全缺失，细菌的在运动过程中丧失逆转功能。敲除che2簇导致趋化能力部分降低，逆转频率降低。而cheA2缺失后不影响细胞的趋化能力及运动轨迹，说明cheA2不参与YIC4027的趋化过程，推测che2簇中的其它基因参与了趋化过程。che2的缺失使得胞外多糖产量低，说明che2基因簇调控YIC4027胞外多糖的生成。检测了这些突变体与宿主植物田菁的共生能力，敲除che1基因簇或者cheA1使得菌株的竞争性根际定殖和竞争性结瘤能力降低。而che2簇对菌株与田菁共生能力的影响较小。
4. 鉴定了E. alkalisoli YIC4027中的新型趋化基因cheT，该基因位于趋化簇che1的末端，在α-变形菌纲中广泛存在，编码一类未知功能蛋白，其功能目前仍不清楚。该基因缺失后使得该菌株的趋化能力几乎完全丧失。与野生型相比，ΔcheT运动轨迹发生改变，逆转频率增加。cheT基因的缺失还导致合成胞外多糖相关基因的转录水平上调，进而促进了胞外多糖的合成。然而其在宿主田菁根际的竞争性定殖和竞争性结瘤能力降低。据此推测，cheT是一个新型趋化基因，在E. alkalisoli YIC4027的趋化系统中起着重要作用。这些研究表明了E. alkalisoli YIC4027趋化系统的复杂性。
综上所述，在黄河三角洲一些耐盐植物根际微生物菌群中，剑菌属占有主导地位。田菁根瘤菌E. alkalisoli YIC4027的结瘤因子及蛋白分泌系统可能是造成宿主特异性的原因，YIC4027复杂的趋化系统影响菌株的运动性、调控菌株的根际定殖。本研究结果能够为田菁根瘤菌菌剂的开发应用提供理论依据。 |
| 语种 | 中文
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| 文献类型 | 学位论文
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| 条目标识符 | http://ir.yic.ac.cn/handle/133337/25313
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| 专题 | 中国科学院烟台海岸带研究所知识产出_学位论文
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推荐引用方式
GB/T 7714 |
党消消. 滨海耐盐植物田菁共生根瘤菌的宿主特异性分析及趋化功能研究[D]. 烟台海岸带研究所. 中国科学院大学,2020.
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文件名：
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党消消博士毕业论文.pdf
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