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四溴双酚A和十溴二苯乙烷对紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的生殖内分泌干扰效应研究
王爽
Subtype博士
Thesis Advisor吴惠丰
2022-05-18
Training institution中国科学院烟台海岸带研究所
Degree Grantor中国科学院大学
Degree Name理学博士
Degree Discipline海洋生物学
Keyword四溴双酚A 十溴二苯乙烷 紫贻贝 生殖内分泌干扰 转录组学
Abstract四溴双酚A(TBBPA)和十溴二苯乙烷(DBDPE)作为典型的溴系阻燃剂,已在多种海洋环境介质中被检出,其检出量和检出率呈逐年上升趋势,对海洋生态系统健康造成潜在风险。已有研究表明,TBBPA和DBDPE可显著影响脊椎动物的生殖内分泌系统,但对无脊椎动物的生殖内分泌干扰效应及其作用机制的研究相对较少。本研究以代表性无脊椎动物紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)为研究对象,利用传统毒理学研究方法结合高通量转录组学分析,探究了TBBPA和DBDPE对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应及其作用机制,为评估TBBPA和DBDPE污染的海洋生态风险提供重要参考。研究结果如下: 1. TBBPA对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应及其作用机制 增殖期紫贻贝经0、0.6、3、15、75和375 μg/L TBBPA暴露30 d后,利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术测定紫贻贝全软组织中TBBPA富集量,结果显示,紫贻贝全软组织中TBBPA富集量在所有浓度TBBPA暴露组中均显著增加(P < 0.01),其含量范围为62.32 ~ 11176.81 ng/g干重。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测紫贻贝性别特异性基因(卵黄膜细胞溶素受体VERL和卵黄膜细胞溶素VCL)的表达水平,鉴定紫贻贝性别,并根据VERL和VCL的表达水平揭示TBBPA诱导紫贻贝性腺发育的趋势。结果显示VERL和VCL的表达水平变化随TBBPA暴露浓度升高呈U型曲线,表明TBBPA促进了雌雄紫贻贝的性腺发育,并诱导配子排放。利用组织病理学研究方法,观察了TBBPA暴露后紫贻贝性腺发育状况并计算性腺指数(GI)。结果显示,GI与TBBPA暴露浓度呈剂量依赖性增加趋势,TBBPA暴露组大部分个体均已发育至排放期或休止期,其中75和375 μg/L TBBPA对雌雄紫贻贝的性腺发育周期具有显著促进作用(P < 0.05)。利用HPLC-MS技术测定了TBBPA暴露后紫贻贝性腺内类固醇激素含量,结果显示75和375 μg/L TBBPA暴露组中类固醇激素含量呈下降趋势,这与紫贻贝配子排放密切相关。以上研究结果表明,TBBPA促进了雌雄紫贻贝的性腺发育,对紫贻贝造成生殖内分泌干扰效应,但其生殖内分泌干扰效应无明显性别差异。转录组学分析结果显示,TBBPA诱导雄性紫贻贝产生的差异表达基因(DEGs)数量多于雌性,雌雄紫贻贝共同富集的GO条目和KEGG通路包括硫酸酯水解酶活性、类固醇激素生物合成途径、不饱和脂肪酸生物合成途径和花生四烯酸代谢等。进一步分析TBBPA对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应作用机制发现,紫贻贝体内TBBPA生物转化途径可能包括I/Ⅱ/Ⅲ相代谢途径(细胞色素P450s CYPs、谷胱甘肽-S-转移酶GST和P-糖蛋白PgP),也包括磺基转移酶(SULT1)介导的TBBPA磺化途径(SULT1B1和SULT1C1)。TBBPA磺化途径中的催化酶(SULT1B1和SULT1C1)和代谢产物(TBBPA硫酸盐)分别引起雌激素磺基转移酶(SULT1E1)和类固醇硫酸酯酶(STS)的过表达。TBBPA对SULT1E1和STS的活性影响存在性别差异,375 μg/L TBBPA显著抑制雌性SULT1E1的活性和雄性STS的活性。综上所述,TBBPA通过干扰雌雄紫贻贝体内类固醇激素磺化和硫酸盐水解过程,影响类固醇激素合成途径,从而对紫贻贝造成生殖内分泌干扰效应。此外,75和375 μg/L TBBPA通过上调酯酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)、ACOX3和CYP2U1的表达,促进脂肪酸β-氧化和花生四烯酸代谢过程,干扰紫贻贝体内的脂质代谢,对其生殖内分泌系统造成毒性效应。 2. DBDPE对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应及其作用机制 生长期紫贻贝经0、1、10、50、200和500 μg/L DBDPE暴露30 d后,利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术测定紫贻贝全软组织中DBDPE富集量,结果显示,紫贻贝全软组织中DBDPE富集量随暴露浓度升高呈增加趋势,在50、200和500 μg/L DBDPE暴露组中显著富集(P < 0.05),其含量范围是121.46 ~ 577.93 ng/g干重。利用qRT-PCR技术检测性紫贻贝别特异性基因(VERL和VCL)的表达水平,鉴定紫贻贝性别,并根据VERL和VCL的表达水平揭示DBDPE诱导紫贻贝性腺发育的趋势,结果显示VERL和VCL的表达水平变化随DBDPE暴露浓度升高分别呈线性增加和倒U型曲线,表明DBDPE促进了雌雄紫贻贝的性腺发育。利用组织病理学研究方法,观察了DBDPE暴露后紫贻贝性腺发育状况,计算GI并定量分析其形态学参数。结果显示,DBDPE对紫贻贝性腺发育的影响具有性别特异性。雌性紫贻贝的GI和VREL表达水平随暴露浓度升高呈增加趋势,最高浓度500 μg/L DBDPE对雌性紫贻贝的性腺发育周期具有显著的促进作用,形态学参数分析结果与性腺发育周期基本一致;与雌性紫贻贝不同,随DBDPE暴露浓度升高,雄性紫贻贝的GI呈增加趋势,50、200和500 μg/L DBDPE暴露组中个体均已发育至排放期,但VC细胞面积在所有浓度DBDPE暴露组中均显著减少,与观察到的性腺发育周期结果不同,推测VC细胞是DBDPE对雄性紫贻贝的主要作用靶点。以上研究结果表明,DBDPE促进了雌雄紫贻贝的性腺发育,对紫贻贝具有性别特异性的生殖内分泌干扰效应。转录组学分析结果显示,DBDPE诱导雄性紫贻贝产生的DEGs数量多于雌性,雌雄紫贻贝无共同富集GO条目和KEGG通路。进一步分析发现,DBDPE对紫贻贝生殖内分泌干扰效应的作用机制具有性别特异性。DBDPE干扰雌雄紫贻贝低密度脂蛋白受体相关蛋白LRPs的表达水平破坏紫贻贝体内胆固醇稳态,下调ABC转运蛋白家族ABCs的表达水平抑制胆固醇的逆转运,导致胆固醇运输紊乱,影响类固醇激素合成底物的获取。DBDPE还通过激活雄性紫贻贝GPR157-IP3-Ca2+级联通路和雌性紫贻贝环磷酸鸟苷cGMP信号分子,激活非基因组途径,进而干扰下游与生殖相关的基因(卵黄膜外层蛋白VMO1、自整合障碍因子Banf1、透明带粘附蛋白ZAN和蛋白钩同源物Hook1等)的表达水平。此外,DBDPE对细胞凋亡和能量代谢的影响也可能干扰紫贻贝的生殖内分泌活动。DBDPE分别通过上调雌性和雄性紫贻贝消化腺内半胱氨酸蛋白酶Caspase和真核细胞翻译起始因子2α激酶Eif2ak2的表达水平,诱导细胞凋亡,影响消化腺的正常功能,从而间接影响紫贻贝的生殖活动。50、200和500 μg/L DBDPE还导致雄性紫贻贝能量需求增加,下调蛋白质消化吸收和氨基酸分解代谢过程信号通路,抑制雄性紫贻贝的能量供应过程,导致雄性紫贻贝体内繁殖能量的可用度降低,而雌性紫贻贝中能量代谢相关基因无显著变化。 3. TBBPA和DBDPE的生殖内分泌干扰效应及其作用机制比较 TBBPA对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应无明显性别差异,而DBDPE对紫贻贝具有性别特异性的生殖内分泌干扰效应,二者均促进了紫贻贝的性腺发育。TBBPA和DBDPE对紫贻贝的生殖内分泌干扰效应作用机制存在较大差异:(1)干扰类固醇激素生物合成途径的机制不同。TBBPA通过上调SULT1E1和STS的表达水平,抑制SULT1E1和STS的酶活性,干扰类固醇激素的磺化和硫酸盐水解过程,影响类固醇激素合成途径;DBDPE通过干扰雌雄紫贻贝LRPs的表达水平破坏胆固醇稳态,下调ABCs的表达水平抑制胆固醇的逆转运,导致胆固醇运输紊乱,影响类固醇激素合成底物的获取。(2)激活非基因组信号通路的调控不同。DBDPE通过激活雄性紫贻贝GPR157-IP3-Ca2+级联通路和雌性紫贻贝cGMP信号分子,激活非基因组途径,进而干扰下游与生殖相关的基因的表达,而TBBPA暴露组中与上述非基因组信号通路相关的基因未发生显著变化。(3)其他可能机制。TBBPA促进了紫贻贝体内脂肪酸β-氧化和花生四烯酸代谢过程,干扰紫贻贝体内的脂质代谢;DBDPE暴露组中与上述脂质代谢相关的基因未发生显著变化。DBDPE诱导雌雄紫贻贝消化腺内分别发生细胞凋亡,影响消化腺的正常功能;DBDPE还导致雄性紫贻贝能量需求增加,抑制能量供应过程,雄性紫贻贝体内繁殖能量的可用度降低;TBBPA暴露组中与细胞凋亡和能量代谢相关的基因未发生显著变化。
Pages168
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.yic.ac.cn/handle/133337/30526
Collection中科院烟台海岸带研究所知识产出
Recommended Citation
GB/T 7714
王爽. 四溴双酚A和十溴二苯乙烷对紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)的生殖内分泌干扰效应研究[D]. 中国科学院大学,2022.
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