菲律宾蛤仔是我国沿海地区重要的经济贝类之一。近年来，由于病原入侵和环境恶化等原因，导致菲律宾蛤仔大规模死亡现象时有报道。通过探究菲律宾蛤仔的免疫调控及免疫防御机制，可为其病害防控提供科学依据。

在生物体固有免疫中，NF-κB信号通路是一种重要的免疫调控信号通路，可以调节多种炎症反应和免疫应答反应。研究发现，NF-κB信号通路具有抑制细胞凋亡及促进细胞凋亡的双向作用，并且细胞凋亡相关基因又在一定程度上参与了NF-κB信号通路的调控。本研究从菲律宾蛤仔中鉴定获得了凋亡相关因子RpFADD，并对其免疫调节功能进行了初步研究；同时，对菲律宾蛤仔免疫效应因子RpMacin的抗菌活性和作用机制进行了探讨，相关结果可为深入解析海洋无脊椎动物免疫学内容提供借鉴。本论文主要获得以下研究结果：

1. RpFADD的分子克隆与免疫功能分析

利用巢式PCR技术，扩增出菲律宾蛤仔FADD基因的全长cDNA序列，命名为RpFADD。通过多序列比对和系统发育树分析表明，RpFADD为FADD家族新成员。荧光定量PCR结果显示，RpFADD转录本在所检测组织中均有表达，且在血淋巴中表达量较高。在藤黄微球菌或鳗弧菌刺激下，RpFADD基因的表达量显著上调，分别在72h和48h达到最高水平。利用RNAi技术敲降RpFADD转录本，发现RpIKK、RpTAK1和RpNF-κB转录本的表达水平显著下调，而RpIκB转录本的表达量显著上调，表明RpFADD可能对NF-κB信号通路具有正调控作用。此外，RpFADD主要定位于细胞质中，其过表达能够促进HeLa细胞的凋亡。

2.  RpMacin的分子克隆与抗菌机制初探

利用巢式PCR技术，扩增出菲律宾蛤仔Macin基因的全长cDNA序列，命名为RpMacin。通过多序列比对和系统发育树分析表明，RpMacin为Macin家族新成员。荧光定量PCR结果显示，RpMacin转录本在所检测组织中均有表达，主要在鳃和肝胰腺中表达，且对鳗弧菌刺激存在显著响应。重组蛋白rRpMacin具有较为广谱的杀菌活性，能够通过增加病原菌的膜通透性，最终导致细胞死亡。研究结果表明，RpMacin在宿主防御侵袭性病原体方面具有重要作用。

第1章 绪论 1

1.1 菲律宾蛤仔养殖现状 1

1.2无脊椎动物的固有免疫 1

1.2.1病原识别 1

1.2.2免疫信号的调整与放大 2

1.2.3病原微生物的清除 2

1.3 NF-κB信号转导 3

1.3.1 NF-κB信号通路主要成员 4

1.3.2 NF-κB信号通路的调节机制 5

1.4 Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）的研究 6

1.5抗菌肽的研究 7

1.6 研究意义、思路及内容 8

1.6.1 研究意义 8

1.6.2研究思路 9

1.6.3 研究内容 9

第2章 菲律宾蛤仔RpFADD克隆、表达和功能分析 11

2.1 实验材料 11

2.1.1 实验样品及处理 11

2.1.2 试剂与仪器 12

2.2 实验方法 13

2.2.1. 菲律宾蛤仔cDNA合成 13

2.2.2目的基因全长cDNA序列的扩增 14

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物 14

2.2.4 质粒提取 14

2.2.5 感受态细胞制备与转化 14

2.2.6 基因序列分析 15

2.2.7 基因表达分析 15

2.2.8 大肠杆菌原核表达 15

2.2.9 多克隆抗体的制备与特异性检测 16

2.2.10 RpFADD基因敲降实验 17

2.2.11 RpFADD的过表达实验 18

2.3 实验结果 20

2.3.1 RpFADD的分子特征 20

2.3.2 RpFADD转录本的组织分布 23

2.3.3 RpFADD转录本对菌刺激的响应 23

2.3.4 RpFADD的重组表达 24

2.3.5 RpFADD转录本的敲降研究 25

2.3.6 RpFADD的过表达研究 28

2.4 讨论 29

第3章 菲律宾蛤仔RpMacin克隆、表达和杀菌活性分析 32

3.1 实验材料 32

3.2 实验方法 32

3.2.10 rRpMacin最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）测定 32

3.2.11 rRpMacin杀菌动力学测定 33

3.2.12 rRpMacin对细胞壁的影响 33

3.2.13 rRpMacin的潜在作用机制研究 33

3.2.14 rRpMacin对磷脂双层膜的影响 34

3.3 实验结果 35

3.3.1 RpMacin的分子特征研究 35

3.3.2 RpMacin转录本的组织分布 36

3.3.3 RpMacin对菌刺激的响应 37

3.3.4 RpMacin的重组表达 38

3.3.5 rRpMacin的抗菌活性 38

3.3.6 RpMacin的杀菌机制研究 40

3.4 讨论 43

第4章 结论与展望 43

4.1 本研究的主要结论 45

4.2 本研究的主要创新点 45